La cromatografia liquida ad alta prestazione (High Performance Liquid Chromatography) o cromatografia liquida ad alta pressione (High Pressure Liquid Chromatography) è un potente strumento di analisi. In questo articolo esamineremo come si esegue e mostreremo come funziona la colonna cromatografica.
L’HPLC è una tecnica in chimica analitica utilizzata per separare e purificare i componenti in una miscela, per identificare ogni componente e per quantificare ciascun componente. Essa si basa su pompe in cui passa un solvente liquido pressurizzato contenente la miscela campione attraverso una colonna riempita con un materiale adsorbente solido. Ogni componente nel campione interagisce in modo diverso con il materiale adsorbente, causando diversi tempi di uscita per i diversi componenti e porta alla separazione dei componenti mentre scorrono sulla colonna cromatografica nella quale vengono trattenuti (ogni sostanza si trattiene in modo diverso).
La Cromatografia può essere definita come un processo di trasferimento di massa che coinvolge l’adsorbimento. l’HPLC si basa su pompe in cui circola un liquido in pressione detto Fase Mobile ed una miscela campione attraverso una colonna riempita con un assorbente detta Fase Stazionaria, che porta alla separazione dei componenti del campione. Il componente attivo della colonna, l’assorbente, è tipicamente un materiale granulare costituito da particelle solide (ad esempio silice, polimeri, ecc) di dimensioni 2-50 micrometri. I componenti della miscela campione sono separati gli uni dagli altri a causa dei diversi gradi di interazione con le particelle adsorbenti. Il liquido in pressione è tipicamente una miscela di solventi (ad esempio acqua, acetonitrile e / o metanolo). La sua composizione e la temperatura gioca un ruolo importante nel processo di separazione influenzando le interazioni che avvengono tra i componenti del campione e assorbente. Queste interazioni sono di natura fisica, come dispersiva, dipolo-dipolo e ionica, più spesso una loro combinazione.
L’HPLC si distingue dalla tradizionale (“bassa”) cromatografia liquida perché le pressioni operative sono significativamente superiori (50-350 atmosfere), mentre la cromatografia liquida ordinaria si basa tipicamente sulla forza di gravità per far circolare la fase mobile attraverso la colonna. A causa della piccola quantità di campione separato nell’HPLC, le dimensioni tipiche della colonna sono 2,1-4,6 mm di diametro e 30-250 mm di lunghezza. Inoltre le colonne HPLC sono realizzate con particelle adsorbenti più piccole (2-50 micrometri mediamente). Questo dà all’HPLC un potere di risoluzione superiore nel separare le miscele, è per questo che è una tecnica cromatografica molto conosciuta.
Lo schema dello strumento di un HPLC comprende tipicamente un campionatore, delle pompe e un rivelatore. Il campionatore porta la miscela campione nel flusso di fase mobile che lo trasporta nella colonna. Le pompe forniscono la portata desiderata e la composizione della fase mobile attraverso la colonna. Il rilevatore è un calcolatore che permette una analisi in continuo dell’uscita della colonna e quindi di poter identificare le sostanze iniettate. Esso genera un segnale proporzionale alla quantità di componente del campione emergente dalla colonna, permettendo quindi anche una analisi quantitativa dei componenti del campione. Un microprocessore digitale ed un software utente consente di controllare lo strumento HPLC, programmare e fornire l’analisi dei dati. Vari rivelatori sono di uso comune, come i rivelatori ad assorbenza, i rivelatori a fluorescenza ed i rivelatori a spettrometro di massa. La maggior parte degli strumenti HPLC hanno anche un forno a colonna che permette di regolare la temperatura della separazione.