{"id":8997,"date":"2015-05-12T19:34:26","date_gmt":"2015-05-12T17:34:26","guid":{"rendered":"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/?p=8997"},"modified":"2024-03-08T19:30:11","modified_gmt":"2024-03-08T18:30:11","slug":"relazione-sulla-preparazione-dei-terreni-di-coltura-e-la-semina-in-piastra-per-spatolamento","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/relazione-sulla-preparazione-dei-terreni-di-coltura-e-la-semina-in-piastra-per-spatolamento\/","title":{"rendered":"Relazione sulla preparazione dei terreni di coltura e la semina in piastra per spatolamento"},"content":{"rendered":"<div class=\"wp-block-image\">\n<figure class=\"aligncenter\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"2048\" height=\"1150\" src=\"http:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/11247186_10204554496570010_436586487_o-min.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-9058\" srcset=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/11247186_10204554496570010_436586487_o-min.jpg 2048w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/11247186_10204554496570010_436586487_o-min-300x168.jpg 300w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/11247186_10204554496570010_436586487_o-min-1024x575.jpg 1024w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/11247186_10204554496570010_436586487_o-min-768x431.jpg 768w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/11247186_10204554496570010_436586487_o-min-1536x863.jpg 1536w\" sizes=\"auto, (max-width: 2048px) 100vw, 2048px\" \/><\/figure>\n<\/div>\n\n\n<div id=\"rtoc-mokuji-wrapper\" class=\"rtoc-mokuji-content frame4 preset2 animation-slide rtoc_open default\" data-id=\"8997\" data-theme=\"eStar\">\n\t\t\t<div id=\"rtoc-mokuji-title\" class=\"rtoc_btn_none rtoc_center\">\n\t\t\t\n\t\t\t<span>Indice dei contenuti<\/span>\n\t\t\t<\/div><ol class=\"rtoc-mokuji decimal_ol level-1\"><li class=\"rtoc-item\"><a href=\"#rtoc-1\">OBIETTIVI:<\/a><\/li><li class=\"rtoc-item\"><a href=\"#rtoc-2\"><strong>CALCOLI e RISULTATI:<\/strong><\/a><ul class=\"rtoc-mokuji mokuji_none level-2\"><li class=\"rtoc-item\"><a href=\"#rtoc-3\"><strong>PROCEDIMENTO:<\/strong><\/a><\/li><li class=\"rtoc-item\"><a href=\"#rtoc-4\"><strong>OSSERVAZIONI:<\/strong><\/a><\/li><li class=\"rtoc-item\"><a href=\"#rtoc-5\"><strong>CONCLUSIONI:<\/strong><\/a><\/li><\/ul><\/li><\/ol><\/div><h2 id=\"rtoc-1\"  class=\"wp-block-heading\"><span class=\"ez-toc-section\" id=\"OBIETTIVI\"><\/span>OBIETTIVI:<span class=\"ez-toc-section-end\"><\/span><\/h2>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\">\n<li><strong>Preparazione del terreno di coltura PCA (<em>Plate Count Agar<\/em>).<\/strong><\/li>\n\n\n\n<li><strong>Semina e conta in piastra per spatolamento di fermenti lattici.<\/strong><\/li>\n<\/ul>\n\n\n\n<h2 id=\"rtoc-2\"  class=\"wp-block-heading\"><span class=\"ez-toc-section\" id=\"CALCOLI_e_RISULTATI\"><\/span><strong>CALCOLI e RISULTATI:<\/strong><span class=\"ez-toc-section-end\"><\/span><\/h2>\n\n\n<div class=\"wp-block-image\">\n<figure class=\"aligncenter size-full\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"555\" height=\"91\" src=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/images.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-19836\" srcset=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/images.png 555w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2015\/05\/images-300x49.png 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 555px) 100vw, 555px\" \/><\/figure>\n<\/div>\n\n\n<p>&nbsp;<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-table has-fixed-layout\"><table class=\"has-fixed-layout\"><tbody><tr><td><strong>STRUMENTI:<\/strong><\/td><\/tr><tr><td>Bilancia Tecnica;<br>Piastra riscaldante con agitatore magnetico;<\/td><td>Autoclave;<br>Frigorifero;<br>Termostato;<\/td><\/tr><tr><td><strong>MATERIALI BIOLOGICI:<\/strong><\/td><\/tr><tr><td><p>PCA: Plate Count Agar;<\/p><\/td><td>Capsula con fermenti lattici;<\/td><\/tr><tr><td><strong>VETRERIA:<\/strong><\/td><\/tr><tr><td>\n<p>Beuta da 500 mL;<br>Cilindro graduato da 500 mL; Spruzzetta;<br>Imbuto;<br>Vetrino d\u2019orologio;<br>Magnete;<br>Spatola di plastica monouso;<br>Pipetta monouso graduata (10 mL);<\/p>\n<\/td><td>Bacchettina di vetro;<br>Spatola d\u2019acciaio;<br>Cotone idrofilo e garza (15x15cm); Becherino da 100 mL;<br>Piastra petri;<br>Bacchette recupera magnete;<br>Provette con porta provette;<br>Pipetta monouso graduata (1 mL);<\/td><\/tr><tr><td><strong>MATERIALI CHIMICI:<\/strong><\/td><\/tr><tr><td>\n<p>H<sub>2<\/sub>O distillata;<\/p>\n<\/td><td>Soluzione fisiologica al 0,9%;<\/td><\/tr><tr><td><strong>DPI DA UTILIZZARE:<\/strong><\/td><\/tr><tr><td>\n<p>Camice;<\/p>\n<\/td><td>Guantoni isolanti;<\/td><\/tr><tr><td><strong>RISCHI:<\/strong><\/td><\/tr><tr><td>Inalazione di sostanza chimiche;<\/td><td>\n<p>Scottature al fornello elettrico;<\/p>\n<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n<div id=\"bmscience4069862745\" style=\"margin-top: 15px;margin-bottom: 15px;margin-left: auto;margin-right: auto;text-align: center;\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/3SoEfdS\" target=\"_blank\" aria-label=\"Screenshot 2025-05-28 195542\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-195542.png\" alt=\"\"  srcset=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-195542.png 1438w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-195542-300x61.png 300w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-195542-1024x207.png 1024w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-195542-768x155.png 768w\" sizes=\"auto, (max-width: 1438px) 100vw, 1438px\" width=\"1438\" height=\"290\"  style=\"display: inline-block;\" \/><\/a><\/div>\n\n\n<h3 id=\"rtoc-3\"  class=\"wp-block-heading\"><span class=\"ez-toc-section\" id=\"PROCEDIMENTO\"><\/span><strong>PROCEDIMENTO:<\/strong><span class=\"ez-toc-section-end\"><\/span><\/h3>\n\n\n\n<p>Per preparare il terreno di coltura <strong>PCA<\/strong>, sono richieste diverse operazioni:<\/p>\n\n\n<div id=\"bmscience2130514352\" style=\"margin-top: 15px;margin-left: 15px;float: right;\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/4dIkWpW\" target=\"_blank\" aria-label=\"Screenshot 2025-05-28 200302\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-200302.png\" alt=\"\"  srcset=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-200302.png 442w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-28-200302-300x229.png 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 442px) 100vw, 442px\" width=\"300\" height=\"229\"   \/><\/a><\/div>\n\n\n<ol class=\"wp-block-list\">\n<li>Si leggono attentamente le indicazioni riportate sulle confezioni (quantit\u00e0 da pesare, temperatura e modalit\u00e0 di sterilizzazione e scioglimento). Nel nostro terreno le indicazioni sono di 23,5 g in 1 L.<\/li>\n\n\n\n<li>Si risale alla quantit\u00e0 di polvere da pesare facendo le giuste proporzioni. Sapendo che per ogni piastra si utilizzano 20 mL, si dovranno preparare 460 mL per ottenere 23 piastre. I 460 mL dovranno essere preparati inoltre da 4 gruppi, quindi 115 mL a testa. Seguendo la proporzione nei calcoli, ogni gruppo deve prelevare 2,7 g di PCA.<\/li>\n\n\n\n<li>Dopo aver effettuato i giusti calcoli, si prepara il materiale occorrente (elencato gi\u00e0 precedentemente).<\/li>\n\n\n\n<li>Si preleva la quantit\u00e0 calcolata di terreno disidratato utilizzando una spatola d\u2019acciaio, un vetrino d\u2019orologio e la bilancia tecnica. Durante questo procedimento bisogna agire con cautela perch\u00e9 si stanno manipolando sostanze chimiche molto leggere e soprattutto si possono alterare i risultati della bilancia.<\/li>\n\n\n\n<li>Si preleva con un cilindro graduato la giusta quantit\u00e0 di acqua distillata (115 mL).<\/li>\n\n\n\n<li>Si versa parte dell\u2019acqua prelevata nella beuta e poi si inserisce il terreno disidratato all\u2019interno per agevolare lo scioglimento. Adesso si versa la restante acqua cercando di raccogliere i residui di terreno aderiti alle pareti del vetrino d\u2019orologio e alla spatola.<\/li>\n\n\n\n<li>Si inserisce il magnete nella beuta e la si porta a riscaldare a 200 \u00b0C con agitazione a 3 fino a quando la soluzione non diventa limpida. Si copre la beuta con il vetrino d\u2019orologio per evitare l\u2019evaporazione e quindi disidratazione del terreno.<\/li>\n\n\n\n<li>Nel frattempo si prepara un tappo utilizzando cotone idrofilo e una garza 15&#215;15 cm.<\/li>\n\n\n\n<li>Quando la soluzione diventa limpida, si toglie il magnete usando le bacchette magnetiche e si ricopre la beuta con il tappo, in modo tale che gli spigoli della garza siano esterni al collo della beuta per non far cadere il tappo all\u2019interno. Poi si ricopre il tappo con la carta stagnola.<\/li>\n\n\n\n<li>Dopo aver \u201csigillato\u201d la beuta, la si inserisce in autoclave a 121 \u00b0C per 15 minuti per sterilizzare il terreno.<\/li>\n\n\n\n<li>Al termine della sterilizzazione, si distribuisce il terreno nelle varie piastre, ma prima di versare si passa velocemente l\u2019imboccatura della beuta sul becco bunsen per evitare contaminazione. Nella piastra bisogna versare 4-5 mm di terreno spostando leggermente il coperchio e facendo raffreddare il terreno vicino ad un bunsen acceso (l\u2019ideale sarebbe utilizzare una cappa con lampada U.V accesa).<\/li>\n\n\n\n<li>Quando il terreno si \u00e8 solidificato, si chiude la piastra e la si conserva in frigorifero capovolta in pile da massimo 5 piastre avvolte in carta stagnola, oppure in fila da 3.<\/li>\n<\/ol>\n\n\n<div id=\"bmscience3297050268\" style=\"margin-top: 15px;margin-bottom: 15px;margin-left: auto;margin-right: auto;text-align: center;\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/43lbxQe\" target=\"_blank\" aria-label=\"81ZPbQ5iboL._SX3000_\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/81ZPbQ5iboL._SX3000_-scaled.jpg\" alt=\"\"  srcset=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/81ZPbQ5iboL._SX3000_-scaled.jpg 2560w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/81ZPbQ5iboL._SX3000_-300x67.jpg 300w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/81ZPbQ5iboL._SX3000_-1024x230.jpg 1024w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/81ZPbQ5iboL._SX3000_-768x173.jpg 768w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/81ZPbQ5iboL._SX3000_-1536x345.jpg 1536w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/81ZPbQ5iboL._SX3000_-2048x461.jpg 2048w\" sizes=\"auto, (max-width: 2560px) 100vw, 2560px\" width=\"2560\" height=\"576\"  style=\"display: inline-block;\" \/><\/a><\/div>\n\n\n<p>Il terreno \u00e8 quindi pronto per essere utilizzato.\u00a0Prima di eseguire la prova vanno preparate le provette con le varie diluizioni in modo tale da poter ridurre le concentrazioni delle cellule ed ottenere delle piastre in cui le colonie siano contabili. Quindi:<\/p>\n\n\n<div id=\"bmscience1209439405\" style=\"margin-top: 15px;margin-left: 15px;float: right;\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/3GVlRqG\" target=\"_blank\" aria-label=\"Screenshot 2025-05-19 151435\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-19-151435.png\" alt=\"\"  srcset=\"https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-19-151435.png 383w, https:\/\/www.bmscience.net\/blog\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/Screenshot-2025-05-19-151435-300x266.png 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 383px) 100vw, 383px\" width=\"300\" height=\"266\"   \/><\/a><\/div>\n\n\n<ol class=\"wp-block-list\">\n<li>Si inserisce in una provetta tutto il contenuto della capsula di <strong>fermenti lattici<\/strong> e si aggiungono 9 mL di soluzione fisiologica perch\u00e9 bisogna rendere liquidi i campioni solidi.<\/li>\n\n\n\n<li>Si allestisce una serie di provette per le diluizioni 10<sup>-1<\/sup>, 10<sup>-2<\/sup> e 10<sup>-3<\/sup>. Si inseriscono 9 mL di diluente utilizzando una pipetta monouso graduata (10 mL) in ciascuna delle provette.<\/li>\n\n\n\n<li>Con una pipetta monouso graduata (1 mL) si preleva 1 mL di campione e lo si versa nella prima provetta con diluizione 10<sup>-1<\/sup>, si agita bene e si preleva dalla provetta 10<sup>-1<\/sup> 1 mL di campione e lo si versa nella provetta 10<sup>-2<\/sup>. Si mescola bene il contenuto della provetta e si effettua lo stesso procedimento con la provetta con diluizione 10<sup>-3<\/sup>.<\/li>\n\n\n\n<li>Dopo aver effettuato la diluizione, si preleva 0,1 mL di campione dalla diluizione prestabilita (nel mio caso dalla diluizione 10<sup>-1<\/sup>) e la si versa al centro della piastra.<\/li>\n\n\n\n<li>Con molta cautela si spatola e distribuisce la goccia di campione su tutta la superficie del terreno in modo da non ottenere colonie sovrapposte che potrebbero alterare i risultati.<\/li>\n\n\n\n<li>Si inserisce la piastra nel termostato a 37 \u00b0C per 24 h per far avvenire la crescita.<\/li>\n\n\n\n<li>Al termine delle 24 h d\u2019incubazione, la piastra va rimossa dal termostato, quindi si procede alla conta microbica oppure la si conserva in frigorifero.<\/li>\n\n\n\n<li>Per contare le piastre con colonie numerose, si pu\u00f2 dividere la piastra in 4 settori e si moltiplica per 4 il numero delle colonie presenti in un quadrante.<\/li>\n\n\n\n<li>Le colonie vanno contate e segnate con un pennarello sul fondo della piastra in modo da evitare di ricontare pi\u00f9 volte la stessa colonia. Nel mio caso, il numero di colonie era molto elevato quindi \u00e8 stato necessario dividere in quadranti.<\/li>\n\n\n\n<li>Dopo aver contato, i risultati si riferiscono al numero di colonie presenti in piastra, ma non a quelle del campione iniziale. Infatti bisogna moltiplicare questo valore per l\u2019inverso della diluizione effettuata e dell&#8217;inoculo che corrisponde a 0,1 mL &nbsp;e si calcola il numero microbico in UFC\/mL (Unit\u00e0 Formanti Colonie) perch\u00e9 una colonia pu\u00f2 essere originata, oltre che da singole cellule, anche da aggregati di cellule che non si sono separate.<\/li>\n<\/ol>\n\n\n\n<h3 id=\"rtoc-4\"  class=\"wp-block-heading\"><span class=\"ez-toc-section\" id=\"OSSERVAZIONI\"><\/span><strong>OSSERVAZIONI:<\/strong><span class=\"ez-toc-section-end\"><\/span><\/h3>\n\n\n\n<p>Il risultato ottenuto di 940 colonie rilevate, vuol dire che la diluizione utilizzata non era idonea, e bisognava procedere con diluizioni successive perch\u00e9 le colonie dovrebbero essere comprese tra 30 e 300 per avere una migliore accuratezza. Questo perch\u00e9 la conta di colonie al di sopra di 300, oltre ad essere difficile da eseguire, \u00e8 poco attendibile per il sovraffollamento dei microrganismi e l\u2019insufficienza dei nutrienti.<\/p>\n\n\n\n<h3 id=\"rtoc-5\"  class=\"wp-block-heading\"><span class=\"ez-toc-section\" id=\"CONCLUSIONI\"><\/span><strong>CONCLUSIONI:<\/strong><span class=\"ez-toc-section-end\"><\/span><\/h3>\n\n\n\n<p><p>Lo scopo della prova era quello di seminare e contare una piastra tramite la tecnica per spatolamento, una tecnica che \u00e8 molto efficace nella determinazione del numero di cellule presenti in una carica microbica, ma che di per se richiede molta concentrazione e precisione nell\u2019esecuzione.<\/p><\/p>\n\n\n<div id=\"bmscience1602856668\" style=\"margin-top: 15px;margin-bottom: 15px;margin-left: auto;margin-right: auto;text-align: center;\"><a href=\"https:\/\/amzn.to\/3LwxOFy\" target=\"_blank\" aria-label=\"ezgif-15bd77c207ead8f7\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" 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