TITOLO: Conta microbica con camera di burker
OBIETTIVO: Conta microbica delle cellule dei lieviti tramite la camera di Burker.
FORMULE:
Legenda:
media: valore medio di cellule;
n. cellule totali: somma di tutte le cellule contate;
aree contate: numero di celle contate;
volume: valore del volume della cella corrispondente;
x: concentrazione cellulare da determinare;
da considerare: 1 cellula/mm3 = 1000 cellule/mL
CALCOLI e RISULTATI:
Essendo la diluizione 1:100, si aggiunge nel calcolo 102 perché si inserisce l’inverso. Quindi:
STRUMENTI:
- Microscopio Ottico.
MATERIALI BIOLOGICI:
- Lievito disidratato.
VETRERIA:
- Portaprovette con Provettoni (16 x 1 cm);
- Spatola d’acciaio;
- Camera di burker;
- Vetrino coprioggetto;
- Bacchetta di vetro;
- Pipetta monouso.
MATERIALI CHIMICI:
- Soluzione fisiologica in spruzzetta: H2O distillata.
DPI DA UTILIZZARE:
- Camice.
RELAZIONE:
PROCEDIMENTO:
I procedimenti di questa prova si possono riassumere in: preparazione del materiale biologico e della camera di burker, osservazione microscopica e calcolo. Andiamo ad analizzarli:
- Si solubilizza il campione di lievito reidratandolo con dell’acqua distillata. Per farlo bisogna effettuare una diluizione 1:10 disponendo 9 mL di soluzione e 1 mL di lievito in polvere prelevato tramite la spatola di acciaio.
- Si mescola con una bacchetta di vetro la soluzione per renderla omogenea. Si dovrebbe ottenere una soluzione bianco torbida.
- Si effettua una seconda diluizione perché la soluzione è troppo concentrata, quindi si preleva 1 mL del campione già solubilizzato 1:10 e 9 mL di acqua distillata. In questo modo si otterrà una diluizione 1:100.
- Si ripete il procedimento n. 2, questa volta la soluzione è meno torbida.
- Si allestisce la camera di Burker sistemando il vetrino copri oggetti al centro, bloccandolo con le pinze metalliche della camera stessa.
- Con una pipetta monouso si preleva il materiale biologico già diluito e si fa cadere una goccia nella parte laterale al centro. La goccia, in pochi secondi, per capillarità, si espanderà per tutto il reticolo in modo da essere pronto per l’osservazione.
- Si posiziona il vetrino con il preparato sul tavolino portaoggetti, fissandolo con la levetta e allineandolo all’obbiettivo utilizzando le viti di traslazione.
- Si inizia l’osservazione utilizzando le viti macrometriche con l’obbiettivo 4x e, successivamente, quelle micrometriche per mettere bene a fuoco l’immagine.
- Dopo aver focalizzato l’immagine del reticolo con il 4x, si può procedere al cambio dell’obbiettivo e all’osservazione in modo più approfondita delle cellule presenti nel vetrino attraverso il 40x.
- Si inizia la conta delle cellule presenti (nel nostro caso nei rettangoli) e si annota sul quaderno il numero di cellule nelle diverse celle.
Attraverso le formule (elencate precedentemente) ci si calcola la concentrazione cellulare delle cellule considerando la diluizione 1:100.
OSSERVAZIONI, RACCOLTA ED ELABORAZIONE DEI DATI:
L’osservazione vera e propria di questa prova inizia con lo zoom 40x, in cui si delineano in modo corretto le linee di divisione del reticolo nella camera di burker. La zona fondamentale della camera di burker è proprio quella dove è situato il reticolo. Ogni reticolo si divide in 9 quadrati grandi, delimitati da tre linee per ogni lato. I quadrati grandi si suddividono a loro volta in 16 quadrati medi, delimitati da due linee per ogni lato, che formano quadrati piccoli e rettangoli. E’ grazie al reticolo che è possibile effettuare la conta delle cellule e il calcolo della concentrazione.
La prima osservazione effettuata è stata fatta con una diluizione 1:10, però le cellule risultavano eccessivamente ammassate e difficilmente contabili; è stato quindi opportuno effettuare una seconda diluizione per consentire un’adeguata conta.
CONCLUSIONI:
Grazie a questa prova si può capire il meccanismo di allestimento di una camera di burker, effettuare una conta microbica e calcolare la concentrazione cellulare attraverso le formule.